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流行性感冒病毒核酸檢測試劑注冊申報資料

技術(shù)審評指導(dǎo)原則

一、前言

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對流行性感冒病毒（以下簡稱流感病毒）核酸檢測試劑注冊申報資料的準備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門對注冊申報資料的技術(shù)審評提供參考。

本指導(dǎo)原則是對流感病毒核酸檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細化。

本指導(dǎo)原則是對申請人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細的研究資料和驗證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規(guī)和標準的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。

二、適用范圍

流感病毒核酸檢測試劑是指利用熒光探針PCR或其他類分子生物學(xué)方法，以特定的流感病毒基因序列為檢測目標，對人咽拭子、呼吸道洗液、抽吸液或其他呼吸道分泌物樣本中的流感病毒進行體外定性檢測的試劑。

本指導(dǎo)原則適用于進行首次注冊申報和相關(guān)許可事項變更的產(chǎn)品。

三、注冊申報資料要求

（一）綜述資料

流感病毒包括甲、乙、丙三型，甲型最容易引起流行，乙型次之，丙型極少引起流行。依據(jù)病毒顆粒外膜血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）蛋白抗原性的不同，甲型流感病毒目前可分為16個H亞型（H1-H16）和9個N亞型（N1-N9），目前已有H1、H2、H3、H5、H7和H9等亞型有人感染的報道。由于編碼HA和（或）NA的核苷酸序列容易發(fā)生突變，致使HA和（或）NA的抗原表位發(fā)生改變，這種抗原性的改變使人群原有的特異性免疫力失效，故甲型流感病毒常引起較大規(guī)模甚至世界性的流感流行。按照流行特點，造成人間流感流行的流感病毒可區(qū)分為季節(jié)性流感病毒和新型甲型流感病毒。季節(jié)性流感病毒通常在年度間發(fā)生小范圍的基因變異，這種基因變異會導(dǎo)致微小的抗原性改變，稱為抗原漂移（antigenic drift），因此，季節(jié)性流感病毒雖具有年度特異性且抗原性的改變使感染者不易獲得持久免疫力，但傳播范圍通常局限于較小的人群范圍，一般不會造成太高的發(fā)病率和死亡率，易感人群多為老年人（>65歲）和嬰幼兒（<6歲）。在過去的幾十年中，季節(jié)性流感病毒主要集中在甲型H3N2和H1N1亞型。近年來，新型甲型流感病毒亞型暴發(fā)流行的案例時有發(fā)生。例如，2009年新型甲型H1N1流感病毒造成全球性流感大流行；人感染高致病性禽流感（H5亞型）病毒的病例時有報道，禽類甲型H5N1亞型流感病毒被認為具有造成人間大范圍流感流行的潛力。新型甲型流感病毒通常由于基因的節(jié)段性重組所致，這種大范圍的基因改變易導(dǎo)致病毒抗原特性的重大改變，稱為抗原轉(zhuǎn)變（antigenic shift），新型甲型H1N1流感病毒（2009）即同時包含了禽流感、豬流感和人季節(jié)性流感的基因片段從而導(dǎo)致病毒在抗原水平發(fā)生了明顯改變。由于抗原性的明顯改變以及可能由此造成的病毒毒力的增強，病毒的傳染性和致病嚴重程度都有所增加，故新型甲型流感病毒可能造成更高的發(fā)病率和死亡率。

流感病毒主要經(jīng)空氣飛沫傳播，常引起發(fā)熱、乏力、肌肉酸痛以及輕到中度的呼吸道癥狀，重者可致肺炎、心肌炎和心衰。流感病毒核酸檢測試劑可用于流感的輔助診斷，甲型流感病毒各亞型檢測試劑還可用于區(qū)分季節(jié)性流感病毒和新型甲型流感病毒，并可獲得關(guān)于流感暴發(fā)的流行病學(xué)信息。

用于流感病毒檢測的樣本采集無法標準化，且具有一定的隨意性，利用核酸定量檢測的方法對流感病人進行病情監(jiān)測或療效觀察，并無合理的臨床指導(dǎo)意義，甚至可能導(dǎo)致錯誤的醫(yī)學(xué)解釋，誤導(dǎo)用藥量的增減或其他診療措施，因此，不建議企業(yè)研發(fā)流感病毒核酸的定量檢測試劑。

在注冊申報資料中，流感病毒的命名應(yīng)采用世界衛(wèi)生組織關(guān)于流感病毒毒株命名的相關(guān)要求進行。流感病毒毒株命名包括6個要素：型別/宿主/分離地區(qū)/毒株序號/分離年份（Hn和Nn），H和N分別代表血凝素和神經(jīng)氨酸酶，n是阿拉伯數(shù)字，對于人流感病毒可以省略宿主信息。如名為“A/Shanghai/37T/2009（H1N1）”的病毒株代表2009年在上海分離的以人為宿主的甲型H1N1亞型流感病毒，毒株序號為37T。

綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、研究結(jié)果的總結(jié)評價以及同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容，其中同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從方法學(xué)及不同類型毒株檢出能力等方面寫明擬申報產(chǎn)品與目前市場上已獲批準的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）》（以下簡稱《辦法》）和《體外診斷試劑注冊申報資料基本要求》（國食藥監(jiān)械[2007]609號）的相關(guān)要求。

（二）產(chǎn)品說明書

說明書承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、標本采集及處理、實驗方法、檢測結(jié)果解釋以及注意事項等重要信息，是指導(dǎo)實驗室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對檢驗結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù)，因此，產(chǎn)品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。產(chǎn)品說明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，境外試劑的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準確且符合中文表達習(xí)慣。產(chǎn)品說明書的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請人提交的注冊申報資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻，則應(yīng)以規(guī)范格式對此內(nèi)容進行標注，并單獨列明文獻的相關(guān)信息。

結(jié)合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，下面對流感病毒核酸檢測試劑說明書的重點內(nèi)容進行詳細說明，以指導(dǎo)注冊申報人員更合理地完成說明書編制。

1.【預(yù)期用途】  應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：

（1）試劑盒用于定性檢測人鼻咽拭子、口咽拭子、呼吸道抽吸液、洗液和/或其他呼吸道分泌物樣本的流感病毒RNA，適用樣本類型應(yīng)結(jié)合實際的臨床研究完成情況進行確認。

（2）簡單介紹待測目標的特征，如病毒種系淵源、生物學(xué)性狀、宿主特性、致病性、感染后臨床表現(xiàn)、待測靶基因特征等。

（3）待測人群特征介紹：具有流感樣癥狀的患者、相關(guān)的密切接觸者、地域要求或年齡限制（如有）等。

（4）強調(diào)：實驗操作人員應(yīng)接受過基因擴增或分子生物學(xué)方法檢測的專業(yè)培訓(xùn)，具備相關(guān)的實驗操作資格，實驗室應(yīng)具備合理的生物安全防備設(shè)施及防護程序。

2.【主要組成成份】

（1）說明試劑盒包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息，陰/陽性對照品（或質(zhì)控品）可能含有人源組分，應(yīng)提供其生物學(xué)來源、活性及其他特性；不同批號試劑盒中各組份是否可以互換。

（2） 試劑盒中不包含但對該項檢測必須的組份，企業(yè)應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的名稱、貨號及其他相關(guān)信息。

（3）如果試劑盒中不包含用于核酸分離/純化的試劑組分，則應(yīng)在此注明經(jīng)驗證后推薦配合使用的商品化核酸分離/純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱以及產(chǎn)品貨號等詳細信息。

3.【儲存條件及有效期】

試劑盒的效期穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性、復(fù)融穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性、凍融次數(shù)要求等。

4.【樣本要求】  重點明確以下內(nèi)容：

（1）樣本采集時間點的選擇：是否受臨床癥狀、用藥情況等因素的影響；

（2）對采樣拭子、容器及保存液的要求：對采樣拭子的材質(zhì)要求（包括對拭子頭和拭子桿的要求）、保存容器、轉(zhuǎn)運保存液的要求、轉(zhuǎn)運條件等

（3）樣本采集：具體采集部位及類型，詳述具體的操作方法或列出相關(guān)操作指南文件以指導(dǎo)使用者（最好能夠給出具體圖示），盡量減少由于樣本采集或處理不當對實驗造成的影響

（4）樣本處理及保存：核酸提取前的預(yù)處理、保存條件及期限（短期、長期）、運輸條件等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否須恢復(fù)室溫，凍融次數(shù)限制。

5.【適用機型】所有適用的儀器型號，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。

6.【檢驗方法】  詳細說明實驗操作的各個步驟，包括：

（1）實驗條件：實驗室分區(qū)、實驗環(huán)境的溫度、濕度、空調(diào)氣流方向控制等注意事項。

（2）試劑配制方法、注意事項。

（3）詳述待測樣本及相關(guān)對照品（質(zhì)控品）核酸提取的條件、步驟及注意事項。

  （4）核酸提取方法的詳細介紹。

（5）擴增反應(yīng)前準備：加樣體積、順序等。

（6）RT-PCR各階段的溫度、時間設(shè)置、循環(huán)數(shù)設(shè)置及相關(guān)注意事項。

（7）儀器設(shè)置：特殊參數(shù)、結(jié)合探針的熒光素標記情況對待測基因及內(nèi)標的熒光通道選擇。

（8）基線、循環(huán)閾值（Ct值）的選擇方法。

7.【檢驗結(jié)果的解釋】

結(jié)合陽性對照、陰性對照、內(nèi)對照（內(nèi)標）以及樣本管靶基因檢測結(jié)果的Ct值，以列表的形式對所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解釋進行詳述。如存在檢測灰區(qū)，應(yīng)對灰區(qū)結(jié)果的處理方式一并詳述。另外，如果PCR體系中包含了兩個或以上的熒光探針對靶基因序列進行檢測，則在結(jié)果解釋時，應(yīng)對每個探針所對應(yīng)熒光通道的Ct值的結(jié)果及可能產(chǎn)生的結(jié)果組合均進行合理解釋。說明對何種條件下需要進行重復(fù)檢測以及在重復(fù)檢測時對待測樣本可能采取的優(yōu)化條件等進行詳述。

8．【檢驗方法局限性】

（1）本試劑盒的檢測結(jié)果僅供臨床參考，對患者的臨床診治應(yīng)結(jié)合其癥狀/體征、病史、其他實驗室檢查及治療反應(yīng)等情況綜合考慮。

（2）有關(guān)假陰性結(jié)果的可能性分析

①不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運及處理、樣本中病毒滴度過低均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

②流感病毒待測靶序列的變異或其他原因?qū)е碌男蛄懈淖兛赡軙?dǎo)致假陰性結(jié)果。

③對于突發(fā)的新型甲型流感病毒，其檢測的最適樣本類型及感染后的最佳采樣時間可能尚未確認，因此，在同一患者分次、多部位采集樣本會降低假陰性結(jié)果的可能性。

④未經(jīng)驗證的其他干擾或PCR抑制因子，如……等可能會導(dǎo)致假陰性結(jié)果（如有）。

9.【產(chǎn)品性能指標】 詳述以下性能指標：

（1）對相應(yīng)國家參考品（如有）檢測的符合情況。對于甲型流感通用型核酸檢測試劑，應(yīng)列出所有驗證過的甲型各亞型病毒株的信息；

（2）最低檢測限（分析靈敏度）：說明試劑的最低檢出濃度，建議采用生物學(xué)方式表示病毒滴度，如TCID₅₀或PFU的形式，簡單介紹最低檢測限的確定方法以及對最低檢測限驗證所采用的病毒株信息。

（3） 企業(yè)內(nèi)部陽性/陰性參考品符合率，簡單介紹陽性參考品的來源、濃度梯度、陰性參考品組成、來源以及濃度梯度設(shè)置等信息。

（4） 精密度：精密度參考品的組分、濃度及評價標準。

（5） 分析特異性

①甲型流感病毒各亞型間的交叉反應(yīng)驗證：針對甲型流感病毒亞型檢測的試劑盒，則應(yīng)對較常見的除目的基因外的其他亞型進行交叉反應(yīng)驗證并對結(jié)果進行合理分析。

②交叉反應(yīng)：易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體核酸的驗證情況，建議以列表的方式表示經(jīng)過交叉反應(yīng)驗證的病原體名稱、型別、濃度等信息；

③干擾物質(zhì)：樣本中常見干擾物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，如血液、粘蛋白、膿液等；

④藥物影響：治療感冒或其他呼吸道癥狀患者外用或內(nèi)服的常見藥物對檢測結(jié)果的影響，如常見抗感冒藥物、糖皮質(zhì)激素、抗生素、中藥等。

（6）對比試驗研究（如有）：簡要介紹參比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計學(xué)方法及統(tǒng)計分析結(jié)果。

10.【注意事項】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：

（1）有關(guān)人源組份（如有）的警告，如：試劑盒內(nèi)對照品（質(zhì)控品）或其他可能含有人源物質(zhì)的組分，雖已經(jīng)通過了HBs-Ag、HIV1/2-Ab、HCV-Ab等項目的檢測，但截至目前，沒有任何一項檢測可以確保絕對安全，故仍應(yīng)將這些組份作為潛在傳染源對待。

（2）實驗室管理應(yīng)嚴格按照國家有關(guān)分子生物學(xué)實驗室、臨床基因擴增實驗室的管理規(guī)范執(zhí)行。實驗人員必須進行專業(yè)培訓(xùn)；實驗過程應(yīng)分區(qū)進行（試劑準備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴增和產(chǎn)物分析區(qū)），實驗操作的每個階段使用專用的儀器和設(shè)備，各區(qū)各階段用品不得交叉使用；各區(qū)間人員流動及空氣流向應(yīng)有嚴格要求，最大限度避免交叉污染；實驗用消耗品（如離心管、吸頭等）應(yīng)有合理的清潔和質(zhì)檢程序，避免RNA酶污染或擴增反應(yīng)抑制物造成假陰性結(jié)果。

（三）擬定產(chǎn)品標準及編制說明

擬定產(chǎn)品標準應(yīng)符合《辦法》和《體外診斷試劑注冊申報資料基本要求》的相關(guān)規(guī)定。另外，對于國產(chǎn)試劑，應(yīng)參考《中國生物制品規(guī)程》（2000年版），將擬申報產(chǎn)品的主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品檢定等內(nèi)容作為附錄附于標準正文后，并在正文的“產(chǎn)品分類”項中引出該附錄內(nèi)容。附錄中應(yīng)將待測靶基因的基因位點、全序列，引物/探針序列、來源及驗證情況，各種酶的來源、特性以及驗證等重點內(nèi)容予以明確。

流感病毒核酸檢測試劑的注冊檢測應(yīng)主要包括以下性能指標：物理性狀、試劑盒內(nèi)陰/陽性對照品（質(zhì)控品）的Ct值要求（包括內(nèi)標）、陽性/陰性參考品符合率、精密度、最低檢測限（分析靈敏度）等。陽性參考品主要考察對不同來源的病毒株、不同滴度的檢測符合性，對于甲型流感病毒核酸通用型檢測試劑，在此還應(yīng)考慮不同亞型的覆蓋檢測能力。陰性參考品則是對分析特異性（交叉反應(yīng)）的驗證，應(yīng)主要包括易發(fā)生交叉反應(yīng)的其他病原體的假陽性情況的考核。

如果擬申報試劑已有相應(yīng)的國家/行業(yè)標準發(fā)布，則企業(yè)標準的要求不得低于上述標準要求。

（四）注冊檢測

根據(jù)《辦法》要求，首次申請注冊的第三類產(chǎn)品應(yīng)該在國家食品藥品監(jiān)督管理局認可的、具有相應(yīng)承檢范圍的醫(yī)療器械檢測機構(gòu)進行連續(xù)三個生產(chǎn)批次樣品的注冊檢測。對于已經(jīng)有國家標準品的流感病毒項目，在注冊檢測時應(yīng)采用相應(yīng)的國家標準品進行,對于目前尚無國家標準品的項目，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)建立自己的參考品體系并提供相應(yīng)的內(nèi)部參考品。

（五）主要原材料研究資料

應(yīng)提供主要原材料如引物、探針、企業(yè)參考品或標準品的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量分析和質(zhì)控標準等的相關(guān)研究資料。若主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對穩(wěn)定；如主要原材料購自其它供貨商，應(yīng)提供的資料包括：對物料供應(yīng)商審核的相關(guān)資料、供貨方提供的質(zhì)量標準、出廠檢定報告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗資料。

1．核酸分離/純化組分（如有）的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗證資料。

2．RT-PCR組分的主要材料（包括引物、探針、各種酶及其他主要原料）的選擇、制備、質(zhì)量標準及實驗研究資料，主要包括以下內(nèi)容：

（1） 脫氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP，對純度、濃度、保存穩(wěn)定性等驗證資料。

（2）引物

由一定數(shù)量的dNTP構(gòu)成的特定序列，通常采用DNA合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化。需提供對序列準確性、純度、穩(wěn)定性、功能性實驗等驗證資料。如為外購，應(yīng)提供合成機構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如PAGE電泳結(jié)果或HPLC分析圖譜。

（3） 探針

特定的帶有示蹤物（標記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測。合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或其他適宜方法純化，在5'-端(和/或3'-端)進行標記，并經(jīng)HPLC或其他適宜方法純化。純度應(yīng)達到HPLC純，應(yīng)提供合成機構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明。

（4） PCR反應(yīng)所需酶

DNA聚合酶，應(yīng)具有DNA聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性，如：94℃保溫1小時后仍保持50%活性；尿嘧啶糖基化酶（UNG），具有尿嘧啶糖基化活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性，應(yīng)對酶活性有合理驗證；逆轉(zhuǎn)錄酶，具逆轉(zhuǎn)錄酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性。應(yīng)提供有關(guān)保存穩(wěn)定性、活性及功能實驗等的驗證資料。

3.對照品（質(zhì)控品）的原料選擇、制備、定值過程及試驗資料。

4.核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無DNase和RNase污染。

（六）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

基本生產(chǎn)工藝主要包括：配制工作液、半成品檢定、分裝和包裝。配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均勻，配制過程應(yīng)對pH、電導(dǎo)率等關(guān)鍵參數(shù)進行有效控制。

生產(chǎn)工藝研究資料應(yīng)能對反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如臨床樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件、質(zhì)控體系設(shè)置、Ct（臨界）值確定等，提供確切的依據(jù)，主要包括以下內(nèi)容：

1.主要生產(chǎn)工藝介紹，可以圖表方式表示。

2.反應(yīng)原理介紹。

3.基因位點選擇、RT-PCR方法學(xué)特性介紹。

4.確定最佳RT-PCR反應(yīng)體系的研究資料，包括酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度等。

5.確定RT-PCR反應(yīng)各階段溫度、時間及循環(huán)數(shù)的研究資料。

6．對于基線閾值（threshold）和閾值循環(huán)數(shù)（Ct）確定的研究資料。

7.不同適用機型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別詳述。

另外，對于試劑盒的對照（質(zhì)控）品設(shè)置，建議企業(yè)參考以下要求執(zhí)行：

（1）流感病毒核酸檢測試劑盒的外部對照（質(zhì)控）品應(yīng)至少設(shè)置臨界陽性對照（質(zhì)控）品和陰性對照（質(zhì)控）品，均應(yīng)參與樣本核酸的平行提取，以對核酸提取、RT-PCR反應(yīng)過程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進行合理質(zhì)量控制，企業(yè)應(yīng)對各種對照（質(zhì)控）品的Ct值做出明確的范圍要求。注意，建議采用與實際檢測樣本具有相同或相似性狀的基質(zhì)溶液作為陰性對照（質(zhì)控）品，不推薦采用水作為陰性對照（質(zhì)控）品。

（2）樣本反應(yīng)管應(yīng)設(shè)置合理的內(nèi)對照（內(nèi)標）以對管內(nèi)抑制可能造成的假陰性結(jié)果進行質(zhì)控。申請人應(yīng)對內(nèi)標的引物、探針和模板的濃度做精確驗證，既要保證內(nèi)標熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的競爭性抑制而導(dǎo)致假陰性。對內(nèi)標的Ct值也應(yīng)有明確的范圍要求。

（3）關(guān)于對照品的原料選擇：內(nèi)對照（內(nèi)標）應(yīng)采用具有蛋白外殼的病毒顆粒，如滅活的流感病毒或缺陷病毒（假病毒）等，外部陽性對照可以采用滅活病毒、假病毒或質(zhì)粒。

（七）分析性能評估資料

企業(yè)應(yīng)提交原廠在產(chǎn)品研制階段對試劑盒進行的所有性能驗證的研究資料，包括具體研究方法、內(nèi)控標準、實驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等詳細資料。對于流感病毒核酸類定性檢測試劑，建議著重對以下分析性能進行研究。

1.流感病毒核酸（RNA）提取

病毒RNA提取主要有以下目的：富集靶核酸濃度、保證靶核酸序列的完整性、增加PCR模板溶液均一性、去除PCR抑制物，是決定RT-PCR成敗的要素之一。RNA極易受RNA酶（RNase）的降解，而臨床標本和實驗室環(huán)境中存在大量的RNase，因此，無論申報產(chǎn)品是否含有RNA分離/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)對核酸提取的環(huán)節(jié)做充分的驗證。除最大量分離出目的RNA外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化步驟，盡可能去除PCR抑制物。傳統(tǒng)的RNA分離純化方法（如表面活性劑加蛋白酶結(jié)合氯仿-酚抽提法）和改良方法（如硅磁性微粒吸附法）均有或多或少的優(yōu)勢和不足，申請人應(yīng)結(jié)合申報產(chǎn)品的特性，合理選擇RNA分離/純化試劑，并提供詳細的驗證資料。

2.最低檢測限（分析靈敏度）

（1）最低檢測限的確定

建議使用培養(yǎng)后病毒原液的梯度稀釋液進行最低檢測限確定，每個梯度的病毒稀釋液重復(fù)3-5份，每份進行不少于20次的重復(fù)檢測，將具有90%-95%陽性檢出率的病毒水平作為最低檢測限。通過另制備至少5份最低檢測限濃度水平的病毒稀釋液對90%-95%的檢出率進行確認。建議采用半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(50% tissue culture infectious dose，TCID₅₀）、空斑形成單位（plaque forming units，PFU）法或copies/ml的方式進行病毒濃度確認，并采用上述方式作為病毒濃度的表示方式。在進行最低檢測限的確認時，參與研究的甲型流感病毒各亞型和乙型流感病毒應(yīng)至少包括不同來源的兩個具有代表性的病毒株的系列稀釋梯度。

（2）最低檢測限的驗證

申報試劑應(yīng)在最低檢測限或接近最低檢測限的病毒濃度對每種常見待測流感病毒亞型具有時間和區(qū)域特征性的至少3個病毒株進行驗證。對此，企業(yè)應(yīng)能夠提供用于最低檢測限驗證的各個病毒株的來源、型別確認及滴度確認試驗等信息。用于最低檢測限確定和驗證的病毒株如包括疫苗株，則其應(yīng)能夠體現(xiàn)最近流感發(fā)病季的病毒特點。

3.分析特異性

（1）交叉反應(yīng)

①用于流感病毒核酸檢測試劑交叉反應(yīng)驗證的病原體種類主要考慮以下幾方面可能性：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他微生物。

②建議在病毒和細菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進行交叉反應(yīng)的驗證。通常，細菌感染的水平為10⁶ cfu/ml或更高，病毒為10⁵ pfu/ml或更高。

③首先，應(yīng)在流感病毒不同型別和亞型間進行交叉反應(yīng)驗證；其次，采用其他的病原微生物進行驗證（見表1）。

④申請人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗證的病毒和細菌的來源、種屬/型別和濃度確認等試驗資料。有關(guān)交叉反應(yīng)驗證的信息應(yīng)以列表的方式在產(chǎn)品說明書的【產(chǎn)品性能指標】項中有所體現(xiàn)。

表1   建議用于交叉反應(yīng)性研究的微生物

*項：選擇性驗證

（2）干擾物質(zhì)

①潛在的干擾物質(zhì)主要包括：血液、鼻分泌物或粘液、用于緩解鼻塞和咽部充血、鼻腔干燥、刺激、哮喘和過敏癥狀的藥物（見表2）。

②使用醫(yī)學(xué)相關(guān)水平的干擾物濃度進行驗證，另外，建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度(“最差條件”)條件下進行評價。

③申請人應(yīng)采用每種流感病毒亞型的至少兩種病毒株對呼吸道樣本中物質(zhì)的潛在抑制影響進行評估，建議在每種流感病毒的檢測臨界值水平對每種干擾物質(zhì)的干擾影響進行檢測。

表2  建議用于干擾研究的物質(zhì)

4.精密度

測量精密度的評價方法并無統(tǒng)一的標準可依，可根據(jù)不同產(chǎn)品特征或企業(yè)的研究習(xí)慣進行，前提是必須保證研究的科學(xué)合理性。具體實驗方法可以參考相關(guān)的CLSI-EP文件或國內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評估的文件進行。企業(yè)應(yīng)對每項精密度指標的評價標準做出合理要求，如標準差或變異系數(shù)的范圍等。針對本類產(chǎn)品的精密度評價主要包括以下要求。

（1）對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除申報試劑（包括提取組分和RT-PCR組分）本身的影響外，還應(yīng)對PCR分析儀、操作者、地點等要素進行相關(guān)的驗證。

（2）合理的精密度評價周期，例如：為期至少20天的連續(xù)檢測，每天至少由2人完成不少于2次的完整檢測，從而對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。如有條件，申請人應(yīng)選擇不同的實驗室進行重復(fù)實驗以對室間精密度進行評價。

（3）用于精密度評價的質(zhì)控品應(yīng)至少包括三個水平:

①陰性質(zhì)控品：待測物濃度低于最低檢測限或為零濃度，陰性檢出率應(yīng)為100%（n≥20）。

②臨界陽性質(zhì)控品：待測物濃度略高于試劑盒的最低檢測限，陽性檢出率應(yīng)高于95%（n≥20）。

③陽性質(zhì)控品：待測物濃度呈中度到強陽性，陽性檢出率為100%且CV≤10%（n≥20）。

另外，建議申請人選擇適量臨床采集的新鮮病人樣本（包括所有樣本類型）作為無靶值質(zhì)控品進行精密度評價，以更好地模仿臨床檢測環(huán)境。

5.陽性/陰性參考品

如申報產(chǎn)品有相應(yīng)的國家參考品，則企業(yè)內(nèi)部陽性/陰性參考品應(yīng)參考國家參考品的項目設(shè)置。在不低于國家參考品要求的前提下，申請人可以結(jié)合實際情況設(shè)置合理的企業(yè)內(nèi)部陽性/陰性參考品。對于沒有國家參考品的產(chǎn)品，申請人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗證的實際情況自行設(shè)定企業(yè)內(nèi)部參考品，陽性參考品應(yīng)著重考慮病毒型別、亞型及滴度要求，陰性參考品則主要涉及對分析特異性（交叉反應(yīng)）的驗證情況。

申請人應(yīng)對內(nèi)部陽性/陰性參考品的來源、型別鑒定、病毒滴度等信息進行精確的實驗驗證，并提交詳細的驗證資料。

6.其他需注意問題

對于適用多個機型的產(chǎn)品，應(yīng)提供如產(chǎn)品說明書【適用機型】項中所列的所有型號儀器的性能評估資料。

（八）參考值（參考范圍）確定資料

對于此類試劑，參考值確定資料主要是指Ct值的確認資料，建議申請人采用受試者工作特征（ROC）曲線的方式對申報產(chǎn)品用于結(jié)果判斷的臨界值予以確認。

（九）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、運輸穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實施方案、詳細的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于實時穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

考慮到病毒RNA極易被降解的特性，企業(yè)也應(yīng)對樣本穩(wěn)定性進行研究，主要包括冷藏和冷凍兩種條件下的有效期驗證，可以在合理的溫度范圍內(nèi)選擇3-5個溫度點（應(yīng)至少包括范圍的上限和下限溫度），每間隔一定的時間段即對儲存樣本進行全性能的分析驗證，從而確認不同類型樣本的效期穩(wěn)定性。在對樣本進行效期穩(wěn)定性的評價時，同時應(yīng)對推薦使用的采樣拭子、樣本保存液及保存容器進行合理驗證。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對凍融次數(shù)進行評價。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果均應(yīng)在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細說明。

（十）臨床試驗研究

1.研究方法

對于已有同類產(chǎn)品上市的試劑的臨床研究，選擇境內(nèi)已批準上市、臨床普遍認為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為參比試劑，采用擬申報產(chǎn)品（以下稱考核試劑）與之進行對比試驗研究，證明本品與已上市產(chǎn)品等效或優(yōu)于已上市產(chǎn)品。另外，申請人還應(yīng)選擇一定數(shù)量的新鮮采集樣本進行考核試劑與流感病毒檢測的“金標準”方法--病毒分離培養(yǎng)鑒定方法的比較研究，每種樣本類型不少于30例經(jīng)病毒分離培養(yǎng)方法確定為陽性的樣本。

對于無法選擇參比試劑的新型流感病毒核酸檢測試劑，其臨床研究應(yīng)選擇病毒分離培養(yǎng)鑒定和/或病毒核酸序列測定方法作為參比方法，總例數(shù)不少于500例。用于核酸序列測定的引物序列應(yīng)不同于考核試劑中用于檢測目的基因的引物序列。

另外，對于已被批準上市的甲型流感病毒核酸（通用型）檢測試劑，如果在其注冊證有效期內(nèi)出現(xiàn)了新型甲型流感病毒的暴發(fā)流行，如有需要，生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)迅速針對新的流感亞型開展臨床比對研究，可以采用病毒檢測的“金標準”方法或當時衛(wèi)生行政部門認可的針對該新型甲型流感病毒亞型的診斷標準作為參比方法進行臨床比對研究，分別對采集自新型甲型流感病毒感染（陽性病例不少于30例）、其他常見的流感病毒亞型（如當年流行的季節(jié)性甲型流感病毒）以及非流感病毒感染但具有流感樣癥狀的患者的新鮮樣本進行比對實驗研究，總例數(shù)不少于100例，如臨床試驗研究結(jié)果可以證明其對新型甲型流感病毒亞型的檢測能力，申請人在重新注冊時應(yīng)考慮到因病毒株變化而導(dǎo)致預(yù)期用途發(fā)生實際改變的因素，同時提出變更申請，并按相關(guān)法規(guī)要求提交分析性能評估和臨床試驗研究等資料。

2.臨床研究單位的選擇

考慮到流感病毒不同病毒株的區(qū)域性特征較強，故建議申請人在國內(nèi)不同區(qū)域選擇臨床單位，盡量使各單位的臨床樣本有一定的區(qū)域代表性；臨床研究單位應(yīng)具有呼吸道疾患診療和分子生物學(xué)方法檢測的優(yōu)勢，實驗操作人員應(yīng)有足夠的時間熟悉檢測系統(tǒng)的各環(huán)節(jié)（儀器、試劑、質(zhì)控及操作程序等），熟悉評價方案。在整個實驗中，考核試劑和參比方法都應(yīng)處于有效的質(zhì)量控制下，最大限度保證試驗數(shù)據(jù)的準確性及可重復(fù)性。

3.臨床試驗方案

臨床試驗實施前，研究人員應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計科學(xué)合理的臨床研究方案。各臨床研究機構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個臨床試驗過程中遵循預(yù)定的方案實施，不可隨意改動。整個試驗過程應(yīng)在臨床研究機構(gòu)的實驗室內(nèi)并由本實驗室的技術(shù)人員操作完成，申報單位的技術(shù)人員除進行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實驗進程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。

試驗方案中應(yīng)確定嚴格的病例納入/排除標準，任何已經(jīng)入選的病例再被排除出臨床研究都應(yīng)記錄在案并明確說明原因。在試驗操作過程中和判定試驗結(jié)果時應(yīng)采用盲法以保證試驗結(jié)果的客觀性。各研究單位選用的參比試劑及所用機型應(yīng)完全一致，以便進行合理的統(tǒng)計學(xué)分析。另外，考核試劑的樣本類型不應(yīng)超越參比試劑對樣本類型的檢測要求，如果選擇了參比試劑適用樣本類型以外的樣本，則應(yīng)選擇病毒分離培養(yǎng)鑒定或其他合理方法對額外的樣本類型進行驗證。

4.病例選擇及樣本類型

臨床試驗應(yīng)選擇具有流感癥狀/體征(例如：咳嗽、鼻塞、鼻漏、咽喉疼痛、發(fā)燒、頭疼、肌痛)、流感相似癥狀或有密切接觸史的人群作為研究對象。患者流感癥狀出現(xiàn)后，流感病毒在鼻腔或氣管分泌物中的濃度在24-48小時內(nèi)將保持較高水平，但在不同年齡段人群可能有一定差異，在兒童體內(nèi)的持續(xù)時間更長。申請人在建立病例納入標準時，應(yīng)考慮到各年齡段人群的差異，盡量覆蓋各個年齡段人群。在進行結(jié)果統(tǒng)計分析時，除總體病例數(shù)的要求外，建議對各年齡段人群分層進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 。

對于新型甲型流感病毒亞型核酸檢測試劑，如新型甲型流感病毒（2009流行株）、高致病性禽流感病毒H5亞型等，其臨床研究所選擇病例除新型甲型流感病毒感染者及密切接觸者外，還應(yīng)包括其他當年流行的季節(jié)性流感病毒感染患者、非流感病毒感染但具有流感樣癥狀的患者等。其臨床研究應(yīng)能夠體現(xiàn)該產(chǎn)品對新型甲型流感病毒核酸檢測的特異性。

臨床試驗中所涉及的樣本類型應(yīng)為實際臨床檢測中常用的樣本類型。通常，我們建議對于每種樣本類型應(yīng)有不少于100例的陽性病例，對于陰性病例的選擇，也應(yīng)考慮到交叉反應(yīng)的需要，以從臨床角度考察其分析特異性。

5.統(tǒng)計學(xué)分析

對臨床試驗結(jié)果的統(tǒng)計應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計方法，如檢測結(jié)果一致性分析、受試者工作特征（ROC）曲線分析、陰/陽性符合率等。對于本類產(chǎn)品對比實驗的等效性研究，常選擇交叉四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對定性結(jié)果進行四格表卡方或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結(jié)果的一致性，統(tǒng)計分析應(yīng)可以證明兩種方法的檢測結(jié)果無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。在臨床研究方案中應(yīng)明確統(tǒng)計檢驗假設(shè)，即評價考核試劑與參比試劑是否等效的標準。

6.結(jié)果差異樣本的驗證

在數(shù)據(jù)收集過程中，對于兩種試劑檢測結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)采用“金標準”方法或臨床上普遍認為質(zhì)量較好的第三種同類試劑進行復(fù)核，同時結(jié)合患者的臨床病情對差異原因及可能結(jié)果進行分析。

7.臨床試驗總結(jié)報告撰寫

根據(jù)《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，臨床試驗報告應(yīng)該對試驗的整體設(shè)計及各個關(guān)鍵點給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對整個臨床試驗實施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析方法。建議在臨床總結(jié)報告中對以下內(nèi)容進行詳述。

（1）臨床試驗總體設(shè)計及方案描述

① 臨床試驗的整體管理情況、臨床研究單位選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。

② 病例納入/排除標準、不同年齡段人群的預(yù)期選擇例數(shù)及標準。

③ 樣本類型，樣本的收集、處理及保存等。

④ 統(tǒng)計學(xué)方法、統(tǒng)計軟件、評價統(tǒng)計結(jié)果的標準。

（2） 具體的臨床試驗情況

① 申報試劑和參比試劑的名稱、批號、有效期及所用機型等信息。

② 對各研究單位的病例數(shù)、年齡分布情況進行總合，建議以列表或圖示方式給出具體例數(shù)及百分比。

③ 質(zhì)量控制，試驗人員培訓(xùn)、儀器日常維護、質(zhì)控品運行情況，對檢測精密度、質(zhì)控品測量值的抽查結(jié)果評估。

④ 具體試驗過程，樣本檢測、數(shù)據(jù)收集、樣本長期保存、結(jié)果不一致樣本的校驗等。

（3） 統(tǒng)計學(xué)分析

① 數(shù)據(jù)預(yù)處理、差異數(shù)據(jù)的重新檢測或第三方驗證以及是否納入最終數(shù)據(jù)統(tǒng)計、對異常值或缺失值的處理、研究過程中是否涉及對方案的修改。

② 陽性符合率、陰性符合率、總體符合率及其95%（或99%）的置信區(qū)間。

③以交叉表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對定性結(jié)果進行四格表卡方或kappa檢驗以驗證兩種試劑定性結(jié)果的一致性。

另外考慮到對不同樣本類型以及不同年齡段人群的檢測結(jié)果可能存在一定差異，故建議對不同樣本類型及不同年齡段人群分別進行統(tǒng)計分析，以對考核試劑的臨床性能進行綜合分析。

（4）討論和結(jié)論

對總體結(jié)果進行總結(jié)性描述并簡要分析試驗結(jié)果，對本次臨床研究有無特別說明，最后得出臨床試驗結(jié)論。

四、名詞解釋

1.分析特異性（Analytical Specificity）：測量程序只測量被測量物的能力。分析特異性用于描述檢測程序在樣本中有其他物質(zhì)存在時只測量被測量物的能力。通常以一個被評估的潛在干擾物清單來描述，并給出在特定醫(yī)學(xué)相關(guān)濃度值水平的分析干擾程度。

注：潛在干擾物包括干擾物和交叉反應(yīng)物。

2.精密度（Precision）：在規(guī)定條件下，相互獨立的測試結(jié)果之間的一致程度。精密度的程度是用統(tǒng)計學(xué)方法得到的測量不精密度的數(shù)字形式表示，如標準差（SD）和變異系數(shù)（CV）。

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